Fisika

Aflatoksin merupakan segolongan senyawa toksik (mikotoksin, toksin yang berasal dari fungi) yang dikenal mematikan dan karsinogenik bagi manusia dan hewan.
Spesies penghasilnya adalah segolongan fungi (jenis kapang) dari genus Aspergillus, terutama A. flavus (dari sini nama "afla" diambil) dan A. parasiticus yang berasosiasi dengan produk-produk biji-bijian berminyak atau berkarbohidrat tinggi. Kandungan aflatoksin ditemukan pada biji kacang-kacangan (kacang tanah, kedelai, pistacio, atau bunga matahari), rempah-rempah (seperti ketumbar, jahe, lada, serta kunyit), dan serealia (seperti gandum, padi, sorgum, dan jagung). Aflatoksin juga dapat dijumpai pada susu yang dihasilkan hewan ternak yang memakan produk yang terinfestasi kapang tersebut. Obat juga dapat mengandung aflatoksin bila terinfestasi kapang ini.
Praktis semua produk pertanian dapat mengandung aflatoksin meskipun biasanya masih pada kadar toleransi. Kapang ini biasanya tumbuh pada penyimpanan yang tidak memperhatikan faktor kelembaban (min. 7%) dan bertemperatur tinggi. Daerah tropis merupakan tempat berkembang biak paling ideal.
Toksin ini memiliki paling tidak 13 varian, yang terpenting adalah B1, B2, G1, G2, M1, dan M2. Aflatoksin B1 dihasilkan oleh kedua spesies, sementara G1 dan G2 hanya dihasilkan oleh A. parasiticus. Aflatoksin M1, dan M2 ditemukan pada susu sapi dan merupakan epoksida yang menjadi senyawa antara.
Aflatoksin B1, senyawa yang paling toksik, berpotensi merangsang kanker, terutama kanker hati. Serangan toksin yang paling ringan adalah lecet (iritasi) ringan akibat kematian jaringan (nekrosis). Pemaparan pada kadar tinggi dapat menyebabkan sirosis, karsinoma pada hati, serta gangguan pencernaan, penyerapan bahan makanan, dan metabolisme nutrien. Toksin ini di hati akan direaksi menjadi epoksida yang sangat reaktif terhadap senyawa-senyawa di dalam sel. Efek karsinogenik terjadi karena basa N guanin pada DNA akan diikat dan mengganggu kerja gen.
Pemanasan hingga 250 derajat Celsius tidak efektif menginaktifkan senyawa ini. Akibatnya bahan pangan yang terkontaminasi biasanya tidak dapat dikonsumsi lagi.

Uji Cemaran Aflatoksin
Pengertian dan prinsip : pemisahan isolate aflatoksin secara kromatografi lapis tipis
Pereaksi khusus : Media dan pengenceran media Yeast Extract Sucrose Broth (YES).
Peralatan khusus : Lemari aseptic, Lampu ultraviolet, Mikropipet 10 ml
Prosedur
Kultur Aspergillus flavus hasil isolate dan identifikasi dari ekstrak diinokulasikan pada permukaan media YES.
Tabung diinokulasikan pada suhu 25 C selama satu minggu dalam posisi miring untuk mendapatkan permukaan yang luas.
Biakan dalam autoklaf pada suhu 120 C selama 15 menit, biakan dibiarkan sampai dingin.
Sejumlah kecil media biakan diambil dengan menggunakan pipet Pasteur dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil atau vial.

Identifikasi
Kromatografi Lapis Tipis
Terhadap media biakan, ekstrak yang diuji dan baku aflatoksin dilakukan kromatografi lapis tipis sebagai berikut : Silika gel (lempeng pelapis)
Kiesel gel 60, Merck
Baku aflatoksin : Merupakan campuran siap pakai terdri dari 5,0 mikrogram aflatoksin B1 ; aflatoksin B2 5,0 mikrogram ; aflatoksin G1 1,5 mikrogram ; aflatoksin G dalam larutan campuran benzen : aseton nitril (98 : 2) (Sigma Chemical Company).
Eluen : campuran kloroform : aseton : n-heksan (85 : 15 : 20).
Jarak rambat : 10 cm
Penampak bercak : Bercak berwarna biru atau hijau kebiruan setelah lempeng diletakkan dibwah cahaya ultraviolet (366 nm), menandakan aflatoksin positif.



















Contoh pengujian aflatoksin pada organ hati ayam yang di duga mengandung aflatoksin

Aflatoksin B1 (AFB1) adalah senyawa racun yang merupakan metabolit sekunder dari Aspergillus flavus
yang tumbuh pada media seperti jagung dan pakan, pada kondisi penyimpanan dan penanganan yang kurang baik terhadap bahan-bahan tersebut. Pakan yang tercemar AFB1 cukup tinggi dapat menyebabkan terdeteksinya residu AFB1 pada produk ternak seperti organ hati. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metoda analisis residu AFBpada sampel organ hati ayam secara ELISA kompetitif langsung. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pereaksi yang baik digunakan untuk mengekstrak sampel hati adalah campuran methanol dan fosfat buffer salin (MeOH: PBS = 1 : 1). Hasil uji limit deteksi yang diperoleh adalah 0,19 + 0,03 ppb dengan presisi yang cukup baik, dimana uji keterulangan memberikan nilai relatifstandar deviasi (RSD) 12,3%. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa respon antibodi spesifik terhadapAFB, Metoda ELISA untuk analisis residu AFBpada hati ayam cukup akurat dengan nilai perolehankembali (recovery) adalah rata-rata 100,8%. Uji ELISA yang dikembangkan diaplikasikan untuk analisisresidu AFB dalam hati ayam yang dikumpulkan dari 9 pasar tradisional dan swalayan didaerah Bogor.Ternyata bahwa dari 11 dari 45 sampel hati yang dianalisis (24,4%) terdeteksi adanya residu AFB

PENDAHULUAN
Isu keamanan pangan semakin banyak dibicarakan di masyarakat, dengan adanya tuntutan jaminan keselamatan konsumen.Pangan yang merupakan produk ternakdiantaranya hati ayam, kemungkinan dapatmengandung residu toksin, seperti aflatoksin.Residu aflatoksin pada produk ternak dapat terdeteksi, karena ternaknya mengkonsumsipakan yang mengandung aflatoksin dengankadar cukup tinggi.Aflatoksin merupakan senyawa racun yangmerupakan metabolit sekunder dari Aspergillus flavus yang dapat tumbuh pada media seperti jagung dan pakan, dan berkembang pada kondisi penyimpanan dan penanganan yangkurang baik. Jenis aflatoksin B1 (AFB) yang banyak dijumpai. Dilaporkan di Indonesiabahwa bahan pakan jagung dan pakan jadinya banyak terkontaminasi aflatoksin
Keberadaan residu AFB dan AFM juga dilaporkan oleh beberapa peneliti pada produk ternak seperti hati dan daging ayam, hati dan daging sapi, telur ayam dan itik serta susu sapi.Bahaya yang ditimbulkan aflatoksin,terutama AFB1 yang paling toksik, yaitu dapat menyebabkan toksisitas akut,kronik, karsinogenik, menimbulkan mutasi genetic (mutagenik), teratogenik kecenderungan menimbulkan penyimpangan pembentukan fisik janin dalam uterus, kanker hati pada manusia. Kejadian penyakit akibat aflatoksin ini dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti umur, jenis kelamin, status pangan dan atau dapat terjadi bersama-sama dengan agen penyebab lain seperti virus hepatitis atau infeksi parasit.
Pentingnya suatu teknik deteksi yang tepat dan akurat diperlukan untuk mengetahui tingkat kontaminasi, selain itu hasil analisis yang akurat membantu upaya pengendalian masalah berkaitan dengan aflatoksin,mencegah terjadinya keracunan aflatoksin, dapat pula sebagai masukan bagi penentu kebijakan atau penyusunan regulasi. Teknik deteksi aflatoksin metoda standard berdasarkan Applied ofm Analytical Chemistry (AOAC, 1984) adalah menggunakan kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography – TLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi (High Performance Liquid Chromatography– HPLC). Metode Enzyme Linked Imunnosorbent Assay (ELISA) sudah banyak dikembangkan dan digunakan karena dinilai cukup cepat, sensitif dan relatif murah. Cepat karena ektraksi sampel lebih sederhana, tidak melalui tahap pemurnian,dan dapat setiap kali pemeriksaan dapat menganalisa sekaligus banyak sampel.Relatif murah, karena sedikit diperlukan jumlah sampel dan reagent serta alat yang lebih sederhana dan murah dibandingkan dengan HPLC. Metode ELISA sudah diterapkan untuk analisis AFB1 pada kacang tanah ,jagung dan pakan ternak dan sampel-sampel biologi seperti urine manusia dan hewan ternak
Limit deteksi untuk analisis metode ELISA dapat membaca serendah 0,1 ug/ml. Pada makalah ini akan disajikan suatu pengembangan metoda analisis residu AFB1 pada hati ayam secara ELISA, akan dipelajari pengaruh matrik sampel hati, pelarut ektraksi yang tepat, pengujian sensitifiti (limit deteksi), repeatibitily (keterulangan), spesifisiti dan akurasi.



MATERI DAN METODE
Pengujian pengaruh matrik sampel hati
Dilakukan dengan mempersiapkan kalibrasistandard (0,12 – 30 ppb AFB1) dalam ekstrak hati yang tidak mengandung AFB1 dan metanol 60%, diuji secara ELISA konpetitif langsung dengan menggunakan pereaksi antigen dan konjugat yang diperoleh Balitvet dari kegiatan penelitian sebelumnya. Tahapan uji ELISA, disajikan pada lampiran 1. Pengukuran ELISA reader dilakukan pada panjang gelombang 450nm. Selanjutnya kalibrasi standard yaitu plot antara % Inhibisi versus konsentrasi AFB1 yang diperoleh, dibandingkan untuk keduanya dan dievaluasi.
Penentuan jenis pelarut yang tepat untuk ekstraksi sampel hati
Dibuat ekstrak hati ayam dengan penimbangan dan penambahan pelarut yang bervariasi seperti berikut: a) 20 gram hati ayam ditimbang, diekstraksi dengan 80 ml campuran metanol/PBS (Posfat Buffer Saline) = 1 : 1; b) 20 g hati ayam diekstrak dengan 20 ml metanol, diambil 5 ml supernatan ditambah 5 ml PBS; c) 10 gram hati ayam diekstraksi 20 ml metanol, 5 ml supernatan diencerkan sampai 10 ml dengan PBS. Selanjutnya kurva standard AFB1 (0,12 – 30 ppb) di uji dalam ekstrak yang disiapkan diatas.
Pengujian sensitifitas (limit deteksi) dan keterulangan (presisi)
Sensitifiti dari alat pembaca ELISA reader ditetapkan pada nilai inhibisi 10 – 15% dari kalibrasi standar AFB1 (0,12 – 30 ppb), yang disiapkan dalam ekstrak hati dengan pelarut yang diperoleh pada uji sebelumnya. Pengujian dilakukan sebanyak 6 kali dan dilakukan pada waktu yang berbeda untuk melihat juga keterulangan yang dapat menunjukkan presisi. Limit deteksi adalah rata2 konsentrasi IC 15.
Pengujian spesifikasi dan akurasi
Uji spesifikasi dilakukan dengan mengukur respon dari jenis aflatoksin yang lain (AFB2, AFG1 dan AFG2 ) pada uji ELISA, sedangkan pengujian akurasi dilakukan dengan mempersiapkan ”spike sample” yaitu sampel hati yang ditambahkan standar AFB1 konsentrasi tertentu (10, 20 dan 40 ppb), selanjutnya diekstrak dengan pelarut yang tepat dan diuji secara ELISA. Dihitung AFB1 yang diperoleh kembali dan persen perolehan kembali (recovery) dapat diketahui.
Analisis sampel hati
Metoda uji yang dikembangkan diaplikasikan untuk analisis sampel hati ayam (45 sampel) yang dikumpulkan dari 9 pasar tradisional dan swalayan didaerah Bogor.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh matrik sampel hati dan penentuan pelarut
ELISA untuk analisis AFB1 pada pakan, jagung dan kacang tanah sudah dikembangkan dan diaplikasikan di lapangan . Dengan menggunakan pereaksi immunokimia antigen dan konjugat yang diproduksi Balai Penelitian Veteriner tersebut pengembangan metoda ELISA dilakukan terhadap sampel produk ternak (hati ayam).
Jenis sampel pada pengujian atau analisis senyawa tertentu dapat mempengaruhi hasil yang diperoleh, disebabkan oleh adanya matrik dalam sampel. Pereaksi yang digunakan untuk mengekstrak AFB1 yang terkandung dalam sampel biasanya adalah metanol, dan pada metoda ELISA dengan antigen dan konjugat yang dipergunakan Balitvet, pelarut pengekstrak sampel adalah metanol 60%. Dapat diamati pengaruh matrik sampel hati dibandingkan dengan standar dalam metanol 60%. Terlihat bahwa kurva kalibrasi standard AFB1 dalam ektrak hati ayam masih belum mendekati kurva kalibrasi standar dalam metanol sebagai acuan, walaupun ada titik yang bersinggungan dalam kurva. Pada konsentrasi AFB1 rendah, efek matrik sangat terlihat dengan kurva yang berjauhan. Pengaruh matrik dapat dihilangkan atau diminimumkan dengan cara a). melakukan pengenceran sampel sebelum dianalisa, tetapi perlu dipertimbangkan sensitifiti dari penetapan, b). menggunakan kombinasi pelarut ekstrak, c). penambahan deterjen atau protein pada pelarut. Pada percobaan ini efek matrik dicoba dengan menggunakan kombinasi pelarut untuk ekstraksi, yaitu metanol dan PBS. Metanol merupakan pelarut organik yang baik, sehingga hampir seluruh matrik termasuk senyawa yang diuji terlarut dalam metanol. PBS dapat mengendapkan sebagian protein dan lemak yang terkandung dalam hati, yang dapat mengurangi efek matrik
Hasil percobaan dengan menggunakan pelarut campuran metanol dan PBS dengan berbagai teknik pengerjaan dan jumlah sampel, dimana kedalam supernatannya ditambahkan standar AFB1 konsentrasi 0,12 – 30 ppb, didapat kurva kalibrasi seperti Gambar 2. Ternyata bahwa penggunaan pelarut campuran metanol dan PBS = 1:1 yang ditambahkan kedalam 20 g hati ayam, merupakan cara yang terbaik. Mengekstrak dulu senyawa uji dalam metanol 100%, kemudian baru pengenceran dengan PBS, masih memperlihatkan efek matrik yang lebih besar dimana kurva bergeser kesebelah kanan.
Sensitifitas dan presisi
Sensitifitas dari suatu penetapan atau analisis dapat ditunjukan dengan nilai dari limit deteksi, seberapa sensitif alat dapat memberikan respon pada konsentrasi terendah dari analit yang ditetapkan. Pada uji secara ELISA, limit deteksi ditetapkan pada konsentasi yang memberikan nilai Inhibisi 15% (IC15), dari pengukuran seri standar dalam matrik sampel yang tidak mengandung AFB1 .
Spesifikasi dan akurasi
Spesifikasi antibody aflatoksin dapat diketahui dari pengujian reaksi silang dengan jenis aflatoksin lain yang mempunyai struktur yang hampir menyerupai AFB1 yaitu AFB2, AFG1 dan AFG2. Persentase reaksi silang dapat diketahui dengan menghitung IC50 dari pengukuran seri standar (0,12 – 30 ppb) dalam matrik sampel hati dari masing-masing jenis aflatoksin dibandingkan terhadap AFB1, dimana respon AFB1 100%, yang sensitif terhadap AFB1, dengan nilai IC50 yang rendah, sedangkan responnya terhadap jenis aflatoksin lainnya tidak sensitif
Dapat dikatakan bahwa antibody memberikan respon yang spesifik terhadap AFB1, dengan reaksi silang yang relatif kecil terhadap AFB2, AFG1 dan AFG2 yaitu masing-masing 5,6; 13,6 dan 1,5%. Akurasi, ketepatan suatu analisis dievaluasi dari hasil uji perolehan kembali dari”spike sample”, yaitu sampel hati yang ditambahkan konsentrasi tertentu AFB1 . Tiga konsentrasi AFB1 dalam”spike sample” yaitu 10, 20 dan 40 ppb dipersiapkan, selanjutnya diuji kadar AFB1 nya secara ELISA. Hasil pengukuran dan perhitungan seperti pada Tabel 3. Perolehan kembali (recovery) rata-rata 100,8% menunjukan metoda yang dikembangkan memberikan akurasi yang baik. Hasil penelitian terdahulu rata-rata perolehan kembali analisis secara ELISA adalah 94 – 108
Kadar residu AFB1 dalam sampel hati ayam
Metoda ELISA yang dikembangkan diaplikasikan untuk analisis sampel hati yang dikumpulkan dari 9 tempat (pasar tradisional dan swalayan) didaerah Bogor. Ternyata dari 45 sampel hati, sebanyak 11 sampel (24,4%) positif mengandung residu AFB1 dalam kisaran 0,2 – 0,7 ppb. Data disajikan pada Tabel 4. Hasil studi yang dilaporkan terdahulu dari 31 sampel hati ayam, sebanyak 14 sampel positif mengandung residu AFB1 dengan kadar rata-rata 0,01 ppb dan 30 sampel mengandung AFM1 kadar rata-rata 12,1 ppb.
Sampel hati yang dikumpulkan dari pasar tradisionil dan swalayan didaerah Jawa Barat ternyata juga mengandung residu AFB1 dan AFM1. 13 dari 21 sampel hati sapi yang dikumpulkan mengandung residu AFB1 dalam kisaran 0,33 – 1,44 ppb Residu AFB1 pada organ hati yang terdeteksi relatif rendah, karena dalam metabolisme tubuh ayam AFB1 berubah menjadi metabolitnya seperti aflatoksikol dan AFM1. Sebagian diekresikan an sebagian terdistribusi di darah, hati, tembolok, dada dan paha. Padapercobaan pemberian 3 ppm AFB1 pada ayam pedaging dan petelur, residu AFB1 dan metabolitnya yang terbentuk, terdeposit di organ hati 10 kali lebih besar dibandingkan jaringan tubuh yang lain

KESIMPULAN
Dari hasil pengembangan metoda analisis residu AFB1 yang dikembangkan dapat disimpulkan bahwa: Metoda ELISA dapat diaplikasikan untuk analisis residu AFB1 pada sampel hati dengan pelarut yang baik adalah campuran metanol dan PBS = 1 : 1. Sensitifiti dan presisi cukup baik dengan nilai limit deteksi yang diperoleh 0,1 + 0,03 ppb. Uji keterulangan memberikan nilai 12,3% RSD (< 20%).Respon spesifik terhadap AFB1 dengan reaksi silang yang kecil terhadap AFB2, AFG1 dan AFG2 yaitu masing-masing 5,6%, 15,6% dan 1,5. Selain itu metoda juga cukup akurat dengan persentase perolehan kembali rata-rata 100,8%. Hasil analisis sampel hati ayam diperoleh sebanyak 11 dari 45 sampel (24,4%) positif mengandung residu AFB1 dengan kadar dalam kisaran 0,2 – 0,7 ppb.

DAFTAR PUSTAKA
AOAC. 1984. Official Methods of Analysis. 14th Ed, AOAC, Arlington VA. Section 26.026 – 26.031; 26.049 – 26.051.
BAHRI, S. dan R. MARYAM. 2003. Mikotoksin berbahaya dan Pengaruhnya terhadap kesehatan hewan dan manusia. Wartazoa14(4): 129 – 142.
BINTVIHOK, A, S. THIENGNIN, K. DOL and S.KUMAGAI. 2002. Residues of aflatoxins in the liver, muscle and eggs of domestic fowl. J. Vet. Med. Sci. 64 (11): 1037 – 1039.
GROOPMEN , J.D, L.G. CAIN and T.W. KENSLER. 1988.Aflatoxin exposure n human populations measurement relationship to cancer. Crit. Rev. Toxicol. 19(2): 113 – 145.
KAWAMURA, A.O., S. NAGAYAMA, S. SATO, K.OHTANI, I. Uand Y. UENO. 1988.Development of aflatoxin immunoassaytechnique of peanut. Mycotoxin Res. 4: 76 – 87.
MABEE, M.S. and J.R. CHIPLEY. 1973. Tissue distribution and metabolism of aflatoxin B1-
14 C in broiler chickens. Appl microbial.25(5): 763 – 769.
MARYAM, R. 1996. Residu aflatoksin dan metabolitnya dalam daging dan hati ayam. Pros. Temu Ilmiah Nasional Bidang Veteriner. Balai Penelitian Veteriner, Bogor. hlm. 336 – 339.